Vitrifikation war keine einzelne Erfindung. Sie entstand, weil Forscher nach und nach verschiedene Probleme bei der Konservierung von Zellen, Embryonen und Organen sowie schließlich bei der Biostase des Menschen lösten.
Das Ziel klingt einfach: wasserreiches Gewebe durch Abkühlen in einen glasartigen Zustand zu versetzen, ohne dass dabei schädliche Eiskristalle entstehen.
Die Umsetzung ist nicht einfach. Kryoprotektiva können toxisch sein. Beim Einbringen der Kryoprotektiva können sich Zellen verformen. Große Proben kühlen ungleichmäßig ab und lassen sich viel schwerer wieder erwärmen; dabei können im Inneren mechanische Spannungen entstehen.
Moderne Verfahren erfordern daher ein abgestimmtes Zusammenspiel mehrerer Komponenten und Arbeitsschritte. Wie gut sie funktionieren, hängt von der chemischen Zusammensetzung der Lösungen, der Perfusion, der Temperaturführung, dem zeitlichen Ablauf, der Form und Größe der Probe sowie den begleitenden Messungen ab.
Vor der Vitrifikation: zusätzliche Schäden durch Kälte
Frühe Kryokonservierung bedeutete weitgehend Einfrieren. Die Kühlung verlangsamte chemische Prozesse, doch Wasser kristallisierte zu Eis.
Bei der Eisbildung reichern sich Salze und andere gelöste Stoffe in der verbleibenden Flüssigkeit an. Dabei können Zellen mechanisch verformt und extrem hohen Konzentrationen gelöster Stoffe ausgesetzt werden, Wasser verlieren und Schäden an ihren Membranen erleiden.
Schnelleres Abkühlen kann die Größe der Eiskristalle begrenzen, doch Wasser ohne Zusätze lässt sich nur bei extrem hohen Abkühlraten in einen glasartigen Zustand überführen. Das funktioniert nur bei extrem dünnen Proben.
Das historische Problem bestand nicht allein darin, eine niedrige Temperatur zu erreichen. Es bestand darin, sie zu erreichen, ohne dass sich Wasser zu schädlichen Kristallen umordnet.
1937 bis 1938: die ersten kinetischen Vitrifikationsexperimente
Basile Luyet schlug 1937 Vitrifikation als Strategie zur biologischen Konservierung vor.
1938 berichteten Luyet und Eugene Hodapp, dass Froschspermien wieder beweglich waren, nachdem ihnen mit einer konzentrierten Saccharoselösung Wasser entzogen worden war und sie anschließend flüssiger Luft ausgesetzt worden waren.
Das ursprüngliche Experiment beruhte auf mikroskopisch dünnen Filmen und extremer Kühlgeschwindigkeit. Es zeigte, dass Vitrifikation physikalisch möglich ist, lieferte aber kein Verfahren, das sich auf ganze Organe übertragen ließ.
Dieser Ansatz heißt heute kinetische Vitrifikation: Der Probe wird so schnell Wärme entzogen, dass sich keine Eiskeime bilden und zu Kristallen heranwachsen können.
Bei größeren Proben stößt dieser Ansatz an seine Grenzen. Mit zunehmender Probengröße wächst das Volumen stärker als die Oberfläche, sodass das Innere einer großen Probe nicht schnell genug abkühlt.
1949: Glyzerin eröffnet neue Möglichkeiten
Christopher Polge, Audrey Smith und Alan Parkes entdeckten 1949, dass Glyzerin Spermien während der Konservierung bei niedriger Temperatur schützen konnte.
Ihr Nature-Bericht belegte die praktische Bedeutung penetrierender Kryoprotektiva.
Diese Moleküle dringen in Zellen ein, binden Wasser und verringern die Eismenge, die sich bei einer bestimmten Temperatur bildet. Außerdem senken sie die schädliche Konzentration gelöster Stoffe während des Einfrierens.
Die Entdeckung veränderte die Kryobiologie grundlegend, weil die Kühlrate nicht mehr die einzige Steuergröße war. Durch die chemische Zusammensetzung der Lösung ließ sich nun beeinflussen, unter welchen Bedingungen Wasser gefriert oder in einen glasartigen Zustand übergeht.
Sie warf zugleich ein neues Optimierungsproblem auf. Eine höhere Konzentration des Kryoprotektivums verhindert die Eisbildung wirksamer, kann aber stärkere chemische und osmotische Schäden verursachen.
1959 bis 1968: mehr Wirkstoffe und stufenweise Beladung
1959 berichteten James Lovelock und Marcus Bishop, dass Dimethylsulfoxid mehrere Zelltypen vor Frostschäden schützte.
DMSO konnte manche Zellmembranen leichter passieren als Glyzerin. Damit ließen sich weitere Zelltypen vor Gefrierschäden schützen; DMSO wird bis heute in Labor und Klinik häufig eingesetzt.
John Farrant untersuchte daraufhin ein Verfahren, bei dem die Konzentration des Kryoprotektivums erhöht und gleichzeitig die Temperatur gesenkt wurde; das Gewebe blieb dabei in einer konzentrierten Lösung, ohne dass die Eisbildung gezielt ausgelöst wurde.
Damit nahm er ein zentrales Merkmal moderner Verfahren vorweg: Das Kryoprotektivum wird bei niedriger Temperatur schrittweise zugeführt, statt warmes Gewebe sofort der vollen Konzentration auszusetzen.
Stufenweise Beladung begrenzt den osmotischen Schock. Bei niedrigerer Temperatur laufen viele chemische Reaktionen langsamer ab, sodass das Gewebe eine sonst schädliche Einwirkung besser vertragen kann.
1968 zeigten Experimente, dass rote Blutkörperchen bei ausreichend hoher Glyzerinkonzentration die Temperatur von flüssigem Stickstoff ohne sichtbares Eis erreichen konnten.
Die grundlegenden Ansätze waren damit bekannt. Es fehlte ein praktischer Weg, sie auf komplexes, durchblutetes Gewebe anzuwenden.
1984: Vitrifikation als Verfahren zur Organkonservierung
Die Arbeit von 1984 mit dem Titel „Vitrification as an Approach to Cryopreservation“ stellte die Vitrifikation als vielversprechendes Verfahren zur Lagerung von Organen in Organbanken vor.
Die Strategie wurde teils Gleichgewichtsvitrifikation genannt. Durch eine ausreichend hohe Konzentration des Kryoprotektivums lässt sich die erforderliche Abkühlrate so weit senken, dass sie auch bei größeren Proben erreichbar ist.
Dieser Ansatz musste drei miteinander verknüpfte Anforderungen erfüllen:
- Bei technisch erreichbaren Abkühl- und Erwärmungsraten darf sich in der Lösung kein Eis bilden.
- Das Organ muss sowohl die Zufuhr als auch das anschließende Auswaschen der Lösung vertragen.
- Das Kryoprotektivum muss jede Region erreichen, bevor die Kühlung beginnt.
Eine Lösung konnte im Reagenzglas hervorragend funktionieren, sich aber für ein Organ als ungeeignet erweisen, etwa wegen des Gefäßwiderstands, langer Diffusionswege oder toxischer Wirkungen.
1985: lebende Embryonen kehren aus dem Glaszustand zurück
William Rall und Gregory Fahy berichteten 1985 von eisfreier Kryokonservierung von Mausembryonen bei −196 °C.
Das war ein entscheidender biologischer Nachweis. Lebende kernhaltige Säugetierzellen konnten das Abkühlen bis zur vollständigen Vitrifikation und das anschließende Wiedererwärmen überstehen.
Embryonen sind allerdings sehr klein. Im Vergleich zu Organen ausgewachsener Tiere lassen sich bei Embryonen die Temperatur und die Konzentration des Kryoprotektivums schnell und gleichmäßig verändern.
Das Ergebnis bestätigte die Methode und machte zugleich das Größenproblem sichtbarer.
Mit zunehmender Größe stellen sich vier Probleme
1. Toxizität der Kryoprotektiva
Die für die Vitrifikation nötige Konzentration kann Proteine, Membranen und den Zellstoffwechsel stören. Die Toxizität hängt von Wirkstoff, Konzentration, Temperatur, Einwirkzeit und Gewebetyp ab.
Das bedeutet: Wie gut ein Kryoprotektivum vertragen wird, hängt nicht allein vom Molekül ab. Entscheidend ist auch, wie das Kryoprotektivum zugeführt und wieder ausgewaschen wird.
2. Osmotischer Stress
Die Zugabe einer konzentrierten Lösung zieht Wasser aus den Zellen. Beim Entfernen der Lösung kann Wasser zu schnell in die Zellen zurückströmen.
Moderne Verfahren begrenzen Veränderungen des Zellvolumens durch eine schrittweise Anpassung der Konzentration, geeignete Trägerlösungen, kontrollierte Temperaturen und gelöste Stoffe, die nicht in die Zellen eindringen.
3. Ungleichmäßige Verteilung
In einem Organ verteilt sich eine Lösung nicht so gleichmäßig wie in einem einfachen Behälter. Das Kryoprotektivum wandert durch Gefäße, durchquert Kapillarwände und diffundiert durch Gewebe.
Gerinnsel, Ödeme, Gefäßerkrankungen, Ischämie und die Blut-Hirn-Schranke können verhindern, dass in allen Geweberegionen die zur Vermeidung von Eisbildung nötige Konzentration erreicht wird.
Deshalb werden bei moderner Perfusion Druck, Durchfluss, Temperatur und die Konzentration des Kryoprotektivums im venösen Abfluss gemessen; das Volumen der zugeführten Lösung allein reicht zur Beurteilung nicht aus.
4. Thermische Gradienten
Eine große Probe kühlt von außen nach innen ab. Dabei ziehen sich die unterschiedlich kalten Bereiche verschieden stark zusammen.
Nahe und unterhalb des Glasübergangs kann das Material Spannungen nicht schnell abbauen. Übersteigt die Spannung die mechanische Festigkeit, können Brüche entstehen.
Abhilfe schufen eine kontrollierte Abkühlrate, Tempern nahe der Glasübergangstemperatur Tg und langsameres Abkühlen im glasartigen Zustand. Diese Prinzipien werden heute auch bei der computergesteuerten Abkühlung menschlicher Körper angewandt.
1990er und 2000er Jahre: Wirkstoffmischungen statt einzelner Kryoprotektiva
Kein einzelnes Kryoprotektivum erfüllte alle Anforderungen optimal. Forscher kombinierten zunehmend Wirkstoffe, die in die Zellen eindringen, sodass jeder zum Schutz beitragen konnte, ohne allein in einer schädlich hohen Konzentration eingesetzt werden zu müssen.
Trägerlösungen sorgten für geeignete Ionenkonzentrationen, pH-Werte und osmotische Bedingungen. Polymere, die nicht in die Zellen eindringen, beeinflussten den Wasserhaushalt des Gewebes und die Eigenschaften der Gefäße.
Synthetische Eisblocker sollten die heterogene Eiskeimbildung und das Wachstum von Eiskristallen hemmen. Dadurch war es weniger nötig, die Eisbildung allein durch eine sehr hohe Konzentration des Kryoprotektivums zu verhindern.
Bei Lösungen wie VS55 und später M22 wurden mehrere Wirkstoffe, Eisblocker und sorgfältig abgestimmte Trägerlösungen mit festgelegten Verfahren zur Perfusion und Temperaturführung kombiniert.
Ein Übersichtsartikel zur Organvitrifikation von 2004 beschreibt Fortschritte bei der Verringerung toxischer Wirkungen und kältebedingter Schäden, bei der Kontrolle der Eiskeimbildung und bei der Organperfusion.
Der wichtige Fortschritt bestand nicht darin, dass die Toxizität verschwand. Forscher lernten, die Belastung durch eine abgestimmte Wahl von Lösungszusammensetzung, Einwirkdauer und Temperatur zu verringern.
Kaninchennieren-Experimente: wichtig und leicht überzubewerten
Arbeiten an Kaninchennieren zeigten, dass ein durchblutetes Säugetierorgan mit einer komplexen Vitrifikationslösung beladen, bis zum Glaszustand gekühlt, wieder erwärmt und transplantiert werden konnte.
In einem der beschriebenen Versuche hielt eine transplantierte Niere ein Kaninchen über längere Zeit als dessen einzige funktionsfähige Niere am Leben.
Dieses Ergebnis ist bedeutsam, weil damit über mikroskopisch kleine Proben hinaus auch die Wiederherstellung der Funktion eines ganzen Organs gelang. Daraus entstand jedoch noch kein verlässliches Verfahren für den klinischen Einsatz.
Die spätere Literatur hält fest, dass langfristiger Transplantationserfolg nicht reproduzierbar erzielt wurde. Die Verteilung und Toxizität der Kryoprotektiva sowie die herkömmliche Erwärmung von außen begrenzten weiterhin den Erfolg.
Damit liegt ein bedeutsamer Machbarkeitsnachweis vor; die zuverlässige Wiederholung und die Übertragung auf größere Organe bleiben jedoch ungelöst.
2015: Konservierungsqualität wird auf synaptischer Ebene sichtbar
Aldehydstabilisierte Kryokonservierung verband chemische Fixierung, Perfusion mit Kryoprotektivum und Vitrifikation in Kaninchen- und Schweinehirnen.
Die Studie von 2015 berichtete nach Erwärmung und Vorbereitung für die Elektronenmikroskopie von klar erkennbaren Membranen, Synapsen, Vesikeln, Myelin und intrazellulären Strukturen.
Sie zeigte, dass die Ultrastruktur von Nervengewebe auch in großen Gehirnen nach eisfreier Konservierung, Lagerung und Wiedererwärmung sehr gut erhalten sein kann.
Dass das Gewebe danach wieder lebensfähig war, zeigte sie nicht. Bei der Aldehydfixierung werden Moleküle im biologischen Material gezielt miteinander vernetzt; mit herkömmlichen Verfahren lässt sich die Funktion des lebenden Gewebes danach nicht wiederherstellen.
Das Experiment zeigte somit, wie gut die Gewebestruktur erhalten blieb; ob eine Wiederbelebung möglich wäre, ließ sich daraus nicht ableiten.
Daraus ergab sich auch eine methodische Schlussfolgerung: Die Qualität der Konservierung sollte anhand der zu erhaltenden Strukturen beurteilt werden; das glasartige Aussehen einer Probe allein genügt nicht.
2023: Nanoerwärmung löst das Erwärmungsproblem bei Rattennieren
Für eine reversible Kryokonservierung ist das Abkühlen nur ein Teil der Aufgabe. Die Erwärmung ist oft schwieriger.
Erfolgt die Erwärmung zu langsam, kann während der Entvitrifikation Eis wachsen. Wird das Organ hauptsächlich von außen erwärmt, können Temperaturunterschiede im Inneren zu Rissen führen.
Bei der Nanoerwärmung werden Eisenoxid-Nanopartikel im Gefäßsystem verteilt und durch ein hochfrequentes magnetisches Wechselfeld erhitzt, um beide Probleme zu lösen.
2023 vitrifizierten Forscher Rattennieren, lagerten sie bis zu 100 Tage, erwärmten sie mittels Nanoerwärmung und transplantierten sie anschließend.
Bei Empfängertieren, denen die eigenen Nieren entfernt worden waren, übernahmen die transplantierten Nieren während des dokumentierten Nachbeobachtungszeitraums die lebensnotwendige Nierenfunktion.
Der Erfolg hing von mehr als der Erwärmung ab. Das Team verwendete eine weniger toxische Lösung und berechnete mithilfe eines Modells, wie das Kryoprotektivum zugeführt werden musste, um im Gewebe die gewünschte Konzentration zu erreichen.
In der Geschichte der Vitrifikation zeigt sich immer wieder: Ist ein Hindernis überwunden, wird das nächste sichtbar; damit das Gewebe seine Funktion wiedererlangt, müssen sämtliche Verfahrensschritte gelingen.
2024 bis 2026: größere physikalische Systeme und funktionsfähiges Nervengewebe
2024 berichteten Forscher über Vitrifikationsversuche mit Volumina von 0,5 bis 3 Litern, die damit in der Größenordnung menschlicher Organe lagen; untersucht wurden die physikalischen Eigenschaften.
Sie kombinierten interne Thermometrie, Tempern, kontrollierte Kühlung und Mikro-CT-Untersuchung. Zudem zeigten sie Nanoerwärmung in Volumina bis zu 2 Litern.
Die Versuche mit den größten Volumina erbrachten vor allem physikalische Nachweise. Sichtbare Eisbildung und Risse müssen zwar vermieden werden; allein daraus folgt jedoch nicht, dass ein Organ von der Größe eines menschlichen Organs seine biologische Funktion wiedererlangt.
2026 berichtete eine PNAS-Studie, dass Gewebe aus dem Hippocampus ausgewachsener Mäuse nach Vitrifikation und Wiedererwärmung kurzfristig wieder funktionsfähig war.
In der Studie wurden die Morphologie, die Reaktionsfähigkeit der Mitochondrien, die Erregbarkeit der Nervenzellen, die synaptische Übertragung und die Langzeitpotenzierung untersucht.
Untersucht wurden Hirnschnitte von Mäusen sowie Ganzhirnpräparate, bei denen die Ausbeute gering war; menschliche Gehirne wurden nicht untersucht. Die Aussagekraft der Studie ist damit begrenzt, ihre Ergebnisse sind dennoch bedeutsam.
Sie zeigte, dass erwachsenes Nervengewebe von Säugetieren elektrophysiologische Funktionen zurückgewinnen kann, nachdem die molekulare Beweglichkeit in einem glasartigen Zustand zum Stillstand gekommen war.
Biostase beim Menschen: Anwendung unter erschwerten Bedingungen
Bei Experimenten zur Lagerung von Organen in Organbanken stehen gesundes Gewebe, ein kontrollierter zeitlicher Ablauf und ein vorbereiteter Zugang zum Gefäßsystem zur Verfügung.
Die Biostase beim Menschen beginnt nach der offiziellen Feststellung des Todes. Erkrankung, warme Ischämie, Gerinnung, Ödeme, Transport und Gefäßerkrankungen können die Verteilung des Kryoprotektivums allesamt beeinträchtigen.
Das unmittelbare Ziel ist, die Gewebestruktur für eine mögliche künftige Reparatur zu erhalten; ein bereits heute nach Kryokonservierung wieder funktionsfähiges Transplantat soll damit nicht bereitgestellt werden.
Deshalb lassen sich aus Laborbefunden keine unmittelbaren Aussagen über die Erfolgsaussichten bei Patienten ableiten.
Wie Tomorrow.bio Vitrifikation an Einsatzbedingungen anpasste
Tomorrow.bio verlagerte die kryoprotektive Ganzkörperperfusion in speziell ausgestattete Rettungswagen. Die Behandlung kann bereits vor Ort beginnen, bevor der Patient in die Schweiz transportiert wird.
Das verändert eine wichtige Einflussgröße, die die Chemie nicht ausgleichen kann: das Ausmaß der Ischämie vor der Perfusion.
Das aktuelle Verfahren verwendet eine auf VM-1 basierende Lösung, deren Zusammensetzung an die Kryoprotektion vor Ort und den anschließenden Transport mit Trockeneis angepasst wurde.
Ein Forschungsprogramm der EBF hat VM-1 unter simulierten Bedingungen nach dem Tod getestet, unter anderem nach einer warmen Ischämie von drei Stunden.
Im Rahmen des Programms wurden Änderungen am Perfusat und am Verfahren erprobt und dabei der Brechungsindex im venösen Abfluss, die Perfusionsdauer, Gewichtsänderungen, die Schrumpfung des Gehirns und die Eisbildung erfasst.
Für die Anwendung beim Menschen ist entscheidend, wie gut sich ein bereits durch Ischämie geschädigter Körper perfundieren lässt; die Vitrifikation einer Lösung unter idealen Bedingungen allein sagt darüber wenig aus.
Messung wurde Teil des Verfahrens
In der frühen Vitrifikationsforschung wurde der Erfolg häufig anhand der Transparenz der Proben, durch Kalorimetrie und Röntgenbeugung oder anhand ihrer Lebensfähigkeit und Funktion nach der Wiedererwärmung beurteilt.
Bei der Biostase des Menschen lässt sich der Erfolg derzeit nicht daran messen, ob der Körper seine Lebensfunktionen wiedererlangt. Die Qualität der Konservierung muss deshalb durch zerstörungsfreie Untersuchungen und ergänzende Messungen an einzelnen Gewebestellen beurteilt werden.
Tomorrow.bio untersucht jeden Patienten mittels CT bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff, um unter einheitlichen Bedingungen die Verteilung des Kryoprotektivums abzuschätzen und Eis oder makroskopische Defekte zu erkennen.
Mit gesonderter Einwilligung können kleinste Proben von Nervengewebe entnommen werden, um Membranen, Synapsen und die lokale Ultrastruktur elektronenmikroskopisch zu beurteilen.
Diese Methoden und ihre Grenzen werden in Verfahren zur Qualitätskontrolle der Biostase beschrieben.
Solche Messungen helfen auch dabei, die Verfahren weiterzuentwickeln. Wenn sich Mängel erkennen und zwischen einzelnen Fällen vergleichen lassen, können die Zusammensetzung der Lösungen und der Verfahrensablauf gezielt angepasst werden.
Was sich verbessert hat und was noch nicht gelöst ist
Moderne Vitrifikationsverfahren ermöglichen Ergebnisse, die mit frühen Einfrierverfahren nicht erreichbar waren:
- Eisfreie Konservierung vieler Zellen, Embryonen und kleiner Gewebeproben.
- Wiederherstellung der Funktion vitrifizierter Tierorgane unter festgelegten Versuchsbedingungen.
- Strukturelle Konservierung auf synaptischer Ebene in fixierten Säugetiergehirnen.
- Computergesteuertes Kühlen und Tempern größerer Systeme.
- Volumetrische Erwärmung durch Technologien wie Nanoerwärmung.
- Beurteilung der Konservierungsqualität mittels CT und Elektronenmikroskopie.
Eine reversible Kryokonservierung des gesamten menschlichen Körpers hat sie nicht hervorgebracht.
Zu den verbleibenden Problemen zählen Ischämie nach dem Tod, ungleichmäßige Perfusion, die Toxizität der Kryoprotektiva, die eingeschränkte Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke und Temperaturunterschiede innerhalb des Körpers; außerdem müssen Risse verhindert und eine sichere, gleichmäßige Erwärmung gewährleistet werden.
Selbst wenn die Gewebestruktur erfolgreich erhalten bliebe, wäre weiterhin ungeklärt, wie sich Schäden reparieren, Lebensfunktionen wiederherstellen und die zum Tod führende Erkrankung oder Verletzung behandeln ließen.
Der Beitrag zu den technischen Herausforderungen der reversiblen Kryokonservierung erläutert diese Unterschiede näher.
Kurz gesagt: die Fortschritte bei der Vitrifikation beruhen auf besseren Kryoprotektiva, verbesserter Perfusion, wirksamerer Vermeidung von Eisbildung, kontrollierter Kühlung und Erwärmung sowie genaueren Untersuchungen der Gewebestruktur. Für kleine Proben sind manche Probleme bereits gelöst; wie sich ein ganzer menschlicher Körper reversibel kryokonservieren ließe, ist weiterhin ungeklärt.
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